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세포 배양에 있어서의 오염의 원인과 대책 (Contamination & Solution for Cell Culture)

2020-08-29
조회수 475

개요

세포 배양에 있어서의 오염 (Contamination) 은 세포 배양 실험실에서 발생하는 문제 중은 확실히 가장 일반적인 문제 이며 때로는 매우 심각한 결과를 초래합니다. 오염 물질은 배지 혈청 및 수중의 불순물, 독소, 가소제 및 세제 등의 화학적 오염 물질세균, 곰팡이, 효모, 바이러스, 마이코 플라스마, 및 다른 세포주에 의한 교차 오염 등 생물학적 오염 물질 의 두 가지 범주로 나눌 수 있습니다. 오염을 완전히 제거하는 것은 불가능하지만, 오염원을 완전히 이해하고 뛰어난 멸균 작업을 수행함으로써 오염의 빈도와 정도를 감소시키는 것은 가능합니다. 이번에는 주요 유형의 생물학적 오염에 관한 개요 를 소개합니다.


오염의 종류

세균

박테리아는 단세포 성 미생물의 거대하고 어디에나있는 무리입니다. 일반적으로 직경이 수 μm의 크기로, 형상은 구형, 나선형 등 다양합니다. 박테리아는 크기 및 빠른 성장 속도로 인해 효모 및 곰팡이와 함께 세포 배양에서 가장 일반적으로 발생하는 생물학적 오염 물질입니다.

세균에 의한 오염은 배양 세포의 육안 검사를 통해 세균 감염 후 수일에서 쉽게 발견됩니다. 세균에 감염된 배양 세포는 일반적으로 탁하게 보이고 표면에 얇은 막이 관찰 될 수도 있습니다. 배지의 pH의 급격한 하락도 종종 관찰됩니다. 낮은 배율의 현미경으로 박테리아는 세포 사이에서 움직이고있는 작은 알갱이처럼 관찰되고 고배율의 현미경으로 관찰하면 개별 세균의 형태를 확인할 수 있습니다. 아래의 이미지는 대장균에 오염 된 접착 성 293 배양 세포입니다.

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그림 1 대장균에 오염 된 접착 성 293 배양 세포의 위상차 현미경의 이미지. 낮은 배율의 현미경으로는 접착 성 세포 사이에 미세한 과립을 볼 수 있지만 개별 박테리아는 식별이 어렵습니다 (A). 검은 사각형으로 둘러싼 부분을 확대하면 대체로 길이 약 2 μm, 직경 약 0.5 μm의 개별 대장균 세포가 해상됩니다. A에서의 검은 사각형의 각 변은 100 μm입니다.


효모

효모는 박테리아 계에 속하는 단세포 성 진핵 미생물로 그 크기는  1μm 에서 40 μm 의 범위에 이릅니다. 세균에 의한 오염뿐만 아니라 효모에 의해 오염된 배양 세포는 오염이 진행되면 심하게 탁해 보입니다. 효모에 오염 된 배양액의 pH는 오염이 심하게 진행하기 전까지는 거의 변화하지 않지만 오염이 진행됨과 동시에 상승합니다. 현미경 개별 효모가 난형 또는 구형의 입자로 관찰되고 더욱 작은 입자로 나타나는 경우도 있습니다. 아래의 이미지는 파종 후 24 시간 이후, 효모에 의해 오염된 접착 성 293 배양 세포를 보여줍니다.

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그림 2 효모에 오염 된 접착 세포 배양중인 293 세포의 위상차 현미경 이미지. 오염원의 효모 세포는 작은 달걀 모양의 입자로 관찰되고 있습니다.


곰팡이

곰팡이는 진핵 미생물의 균사라는 다세포 성 필라멘트로 성장합니다. 오염의 초기에는 배양액의 pH는 안정 상태를 유지하지만, 오염이 심하게 진행되면 pH는 급격히 상승하고 배양액이 혼탁해 지는 경향이 있습니다. 현미경은 균사체는 일반적으로 얇고 얇은 필라멘트 모양으로 보이지만, 더 조밀 한 포자 덩어리로 관찰 될 수도 있습니다. 많은 종류의 곰팡이 포자는 매우 엄격한 생육에 적합하지 않은 환경을 휴면 상태로 살아남아 성장에 적합한 환경이 방문한 경우에만 활성화됩니다.


바이러스

바이러스는 미세한 감염성 물질이며, 숙주 세포의 기구를 이용하여 재생합니다. 그 극히 미세한 크기 때문에, 배양 중의 검출 및 세포 배양 실험실에서 사용되는 시약의 제거는 매우 곤란 합니다. 대부분의 바이러스는 숙주에 대한 요구 가능성이 매우 높고, 일반적으로 숙주 이외의 종류의 세포 배양에 악영향을 미치지 않습니다. 그러나 바이러스에 감염된 세포 배양 물을 사용하는 것은 특히 인간이나 영장류의 세포가 실험실에서 배양되는 경우에는 실험 종사자에게 심각한 건강 위험을 초래할 수 있습니다. 세포 배양의 바이러스 감염은 전자 현미경 관찰, 항체를 이용한 면역 염색, ELISA 분석, 또는 적절한 바이러스에 대응 한 프라이머를 이용한 PCR 법에 의해 감지 할 수 있습니다.


마이코 플라즈마

마이코 플라즈마는 세포벽을 갖지 않는 단순한 박테리아로 자기 복제 가능한 최소의 미생물 인 것으로 간주하고 있습니다. 마이코 플라즈마는 매우 작은 크기 (보통 1 μm 미만) 때문에 매우 고밀도로 성장 세포 배양을 저하 시키게 될 때까지 감지하는 것은 곤란하고, 그런 상태가 될 때까지 감염의 시각 적 징후가 전혀 보이지 않는 경우가 종종 있습니다. 성장 속도가 느린 마이코 플라스마의 일부는 세포 사멸을 유발하지 않고 세포 배양 중에 계속 존재하기도합니다. 그러나 그 경우에도 배양중인 숙주 세포의 활동과 신진 대사를 수정할 수 있습니다. 만성적 인 마이코 플라즈마 감염은 세포 증식 속도 저하, 포화 밀도의 저하, 부유 배양 물의 응집으로 나타나기도 있지만, 마이코 플라즈마 감염을 감지하는 유일한 확실한 방법은 문화를 정기적으로 형광 염색 (예 : Hoechst33258), ELISA, PCR, 면역 염색, 오토 라디오 그래피 또는 미생물 학적 분석을 사용하여 검사 할 수 있습니다.

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그림 3 마이코 플라즈마 감염되지 않은 세포 배양 (패널 A) 및 마이코 플라즈마에 감염된 배양 세포 (패널 B와 C)의 현미경 사진. 배양 시험에는 Invitrogen ™ MycoFluor ™ 마이코 플라즈마 검출 키트를 사용하여 kit에 첨부 된 프로토콜에 따라 검출을 실시했습니다. 고정 세포에서는 MycoFluor ™ 시약은 세포 핵에 도입 된 세포 핵을 강하게 염색되지만 형광 핵 외 물질이 존재하지 않기 때문에 배양은 마이코 플라즈마 오염되지 않은 것을 제안합니다 (패널 A). 마이코 플라즈마에 감염된 고정 세포에서는 MycoFluor 시약은 세포 핵 및 마이코 플라스마 양자를 염색합니다. 핵의 위 또는 근처에 존재하는 마이코 플라즈마는 염색 된 핵 강한 상대 형광을 위해 막연하지만 밝은 핵에서 떨어져있는 마이코 플라즈마는 쉽게 관찰 할 수 있습니다 (패널 B). 살아있는 세포에서는 MycoFluor 시약은 세포 핵에 도입되지 않지만, 세포에 존재하는 마이코 플라즈마는 쉽게 염색됩니다 (패널 C). 이 현미경은 365 nm에서 여기, 100 / 1.3 Plan Neoflaur ™ (Zeiss) 렌즈 및 450 ± 30 nm의 대역 통과 필터를 사용하여 얻은 것입니다.


교차 오염 (Cross contamination)

미생물 오염 정도 일반적이지는 않지만 많은 세포주에서 HeLa 세포와 다른 성장 속도가 빠른 세포주와의 광범위한 교차 오염은 세포배양의 큰 문제이며, 막대한 피해를 가져 올 수 있습니다. 교차 오염을 피하기 위해 신뢰할 수있는 세포 뱅크에서 세포주를 입수하고 세포주의 특성을 정기적으로 검사하고 무균 조작을 철저히하는 것이 도움이됩니다. 사용중인 세포주의 교차 오염의 유무는 DNA 지문 법 핵형 분석 및 동종 형 분석에 의해 확인하는 것이 가능 합니다.